Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
# Количественное определение гепарина в субстанции и готовых лекарственных формах может быть выполнено с использованием реакции антикоагуляции в соответствии с нижеизложенным методом.
Антикоагулянтная активность. Определение активности гепарина проводят биологическим методом по способности его задерживать свертывание нитратной бараньей или бычьей плазмы, путем сопоставления активности испытуемого препарата с активностью гепарина - стандартного образца.
В два ряда тщательно вымытых и высушенных пробирок вносят возрастающее количество рабочих растворов стандартного образца гепарина, испытуемого препарата гепарина и раствора натрия хлорида изотонического 0,9 % в количествах, указанных в таблице. После этого в каждую пробирку прибавляют по 1 мл плазмы, затем по 0,2 мл рабочего раствора кальция хлорида (попеременно в пробирки из ряда с раствором стандартного образца гепарина и испытуемого препарата гепарина), смешивают содержимое осторожно, поворачиванием и легким встряхиванием, не допуская образования пузырей, отмечают время и оставляют при комнатной температуре (или в термостате при температуре 37°С) на 1 ч. По истечении указанного времени определяют состояние плазмы в каждой пробирке и отмечают в каждом ряду крайнюю слева пробирку, в которой не произошло полное свертывание плазмы.
Эти пробирки содержат наименьшие объемы растворов стандартного образца гепарина и испытуемого препарата гепарина, которые задерживают свертывание плазмы.
Порядок внесения раствора
Наименование 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
раствора
Раствор гепарина, мл 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80
Раствор натрия хлорида 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 -
изотонический 0,9 %, мл
Антикоагулянтную активность (Х) препарата, в ЕД/мл, вычисляют по формуле:
X = *-А,
Уг
где
V1 - наименьший объем раствора стандартного образца гепарина,
задерживающий свертывание плазмы, в миллилитрах;
V2 - наименьший объем испытуемого раствора гепарина, задерживающий свертывание плазмы, в миллилитрах;
А - предполагаемая активность.
Определение проводят не менее трех раз и берут средний результат.
Примечания:
1. Приготовление 8 % раствора натрия цитрата. 8 г натрия цитрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.
2. Приготовление 10 % раствора кальция хлорида. 10 г кальция хлорида безводного помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок годности раствора 1 месяц при температуре от 0 до +4°С.
3. Приготовление плазмы. Кровь, вытекающую из сосудов убойного животного, собирают в банки из полиэтилена вместимостью 1 л, содержащие от 25 до 30 мл 8 % раствора натрия цитрата.
Кровь осторожно смешивают с 8 % раствором натрия цитрата, поворачивая баню, и как можно быстрее центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 минут, после чего плазму отсасывают.
Плазму хранят в замороженном состоянии при температуре от -10 до -20°С во флаконах вместимостью от 50 до 150 мл, избегая ее оттаивания.
Перед употреблением плазму размораживают на водяной бане или термостате при температуре 37 ± 0,5°С. Затем плазму фильтруют через марлю, проверяют время ее свертывания и оценивают оптимальное количество кальция хлорида, необходимое для определения активности: в 5 пробирок с 1 мл плазмы в каждой прибавляют возрастающие количества 10 % раствора кальция хлорида (0,02
- 0,04 - 0,06 - 0,08 -0,10 мл) и осторожно смешивают. Для опыта используют плазму, время свертывания которой не превышает 10 минут и то оптимальное количество кальция хлорида, которое вызывает полное свертывание плазмы в указанное время. Найденное оптимальное количество кальция хлорида должно содержаться в 0,2 мл рабочего раствора (этот раствор готовят разведением 10 % раствора кальция хлорида). Срок годности плазмы 1 год при температуре от - 10 до -20°С.
4. Приготовление раствора стандартного образца гепарина. Навеску гепарина
- стандартного образца растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9 % с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 50 ЕД.
Срок годности раствора 6 месяцев при температуре от 0° С до +4 °С.
Предварительно из гепарина - стандартного образца готовят растворы, содержащие в 1 мл 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ЕД. По 0,5 и 0,72 мл полученных растворов помещают в пробирки, доводят объем раствора в пробирке до 0,8 мл раствором натрия хлорида изотоническим 0,9 %. Затем прибавляют по 1 мл плазмы и 0,2 мл кальция хлорида оптимальной концентрации и перемешивают.
